为了分离到足够量、有活力的花原茉莉花原生质体,本试验采用酶解法,针对不同组织器官、不同处理方式、生质时表酶解液组合、体瞬酶解时间等因素进行了摸索和优化。达体
借鉴拟南芥和番茄叶片原生质体制备方法,初步尝试从茉莉花叶片分离原生质体,然而得到的原生质体多为细胞碎片,且形状异常,FDA染色大部分无荧光,显示存活率极低(图1-A,B)。然而,茉莉以茉莉花花瓣为试材时,在相同的酶解液中可收集到形态良好,FDA处理发荧光,有活力的原生质体(图1-C,D),因此在接下来的研究中须专注于优化茉莉花花瓣的原生质体分离体系。
尝试了用切丝法、花原胶撕法和磨砂法在酶解前分别对花瓣组织进行处理(图2-A,生质时表B,C),以使花瓣细胞能充分接触酶解液。在4m1相同酶解液中孵育6h后,体瞬收集观察原生质体产量,在3次独立重复试验中均显示切丝法获得的原生质体数量最多,胶撕法次之,磨砂法得到的原生质体产量最低(图3)。考虑到操作的达体简易性,切丝法处理茉莉花花瓣对原生质体分离最有效。
在含4G·1-1离析酶和2G·1-1果胶酶的酶解液中梯度增加纤维素酶的质量浓度从5至30G·1-1,检测结果显示(图4-A),在一定浓度范围内,原生质体产量随纤维素酶质量浓度提高而增加,当浓度为15G·1-1时,原生质体产量达到峰值,为1.34×106个·G-1,死亡率为29.1％；随着纤维素酶质量浓度继续升高,原生质体产量和活力都开始下降,细胞破碎程度严重。因此,茉莉分离茉莉花花瓣原生质体较适宜的纤维素酶质量浓度为15G·1-1。在含4G·1-1离析酶和15G·1-1纤维素酶的花原酶解液梯度增加果胶酶的质量浓度从2至10G·1-1,花瓣原生质体产量检测结果显示(图4-B),随果胶酶浓度升高,原生质体产量同步增加,当果胶酶质量浓度为8G·1-1时,原生质体产量最高,为1.48×106个·G-1,死亡率较低,为31.0％,较适宜花瓣原生质体的分离.试验表明,酶解液中最佳的纤维素酶和果胶酶质量浓度分别为15和8G·1-1。
为进一步优化茉莉花花瓣原生质体的生质时表分离效率,选取4个酶解时间段3、4、5、6h,采用上述优化后的酶解液组合,检测释放出来的原生质体总量及死亡率。如图4-C所示,随着酶解时间延长,原生质体产量逐步增多,在酶解5h时,原生质体产量最高,达到2.96×106个·G-1,死亡率为23.5％,相对较低.因此最适合酶解时间为5h。
本研究进一步采用PEG介导法,探讨了原生质体终浓度、外源dnA含量、不同PEG处理等对茉莉花花瓣原生质体瞬时转化效率的影响。
将收集的花瓣原生质体稀释成不同终浓度的细胞液,经相同的转化方法和孵育时间,荧光显微镜下统计原生质体转化效率,结果如图5-A所示,相同转化体系中,外源dnA含量为100μG·m1-1原生质体时,最适合转化的茉莉花花瓣原生质体浓度为4×105个·m1-1,转化效率约78％。
向原生质体浓度为4×105个·m1-1的转化体系中加入不同量的P35s-GFP质粒,经相同的PEG处理和孵育时间,结果如图5-B所示,当转化体系中dnA含量为75μG·m1-1原生质体时,转化效率最佳,约为79％。
本研究分析了不同终浓度的PEG4000对茉莉花花瓣原生质体转化效率的影响(图5-C)。在终浓度为200G·1-1的PEG处理下花瓣原生质体的转化效率显著高于其他浓度,其次是150和250G·1-1的PEG终浓度,50G·1-1PEG处理下原生质体转化效率最低。
为进一步优化转化体系,本试验还比较了PEG诱导时间对原生质体转化效率的影响(图5-D)。PEG处理时间在10min以内,原生质体转化效率均达到70％以上,当处理时间超过15min,转化效率显著降低。
声明：本文所用图片、文字来源《福建农业大学学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系
相关链接：茉莉酮，±茉莉酸，茉莉香精，纤维素酶，果胶酶
相关文章：
麦冬的炮制研究进展（一）中国消费者协会点评快递领域不公平格式条款和现象特别约定暗藏猫腻 江苏镇江保险合同点评结果出炉黑附球菌YP1分泌物的广谱抗霉菌活性和化学成分多样性分析（二）城堡剧院正在进行一个600万美元的玻璃更换项目,行业资讯加强合规经营 上海约谈美团等12家电商平台“清朗•打击流量造假、黑公关、网络水军”专项行动启动中国消费者协会等单位联合倡议：反对商品过度包装 践行简约适度理念调查显示市民乐将单层旧窗改成节能玻璃窗,行业资讯婴儿鼻子不通气怎么办,适用的婴儿鼻塞清理方法分享浙江平阳：形式多样地开展“消费宝”宣传推广活动北京专项检查学生餐配送企业食品安全面板需求旺盛 三星却要关闭生产线,行业资讯产销不合格电缆 广东金源宇电线电缆公司被罚296万元离子色谱法测定固体废弃物中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮（三）四星玻璃2016年上半年营业收入和净利润较上年同期有所下降,行业资讯备孕期必备神器：喝太平猴魁，宝宝健康无忧，提高孕率必备！基于耦合技术的牛肉产地溯源（一）伟业计量积分兑换月褐变黑枸杞抗氧化作用的研究（一）福建福州：召开消费维权“降诉增效”行政指导会啄木鸟童装 新潮有型 个性时尚 摒弃平庸GFF触摸屏产品线下移出货量猛增，全产业链大获收益,行业资讯环状糊精的络合作用及其在食品中的应用（一）硫酸铁铵溶液标准物质：铁离子含量校准的专业级溶液甲状腺健康与备孕成功：食物的重要作用和预防措施3D曲面玻璃和2.5D玻璃有何不同？,行业资讯消费者超市购物遭遇捆绑销售 上海市奉贤区市场监管局立案调查山东济南：大力推进线下实体店七日无理由退货水中异丁酸溶液标准物质：助力水质分析浙江缙云金融助企纾困唱响共富歌打击整治养老诈骗专项行动｜祖传“草药”包治百病坑老人 重庆端掉一制售假药黑窝点星星科技3D手环盖板玻璃已批量交货,行业资讯走访市场主体2万家、解决困难5098个……江苏打出“问需于企 助企纾困”组合拳全链条监管食品生产环节食堂被检出多处安全隐患 福州5所高校被约谈浅谈建筑玻璃贴膜节能减排作用,行业资讯山东青岛多部门联合发倡议 呼吁诚信守法经营欠发达地区种养循环农业模式存在的问题及对策（一）"DHA补充在备孕期的重要性：缓解抑郁焦虑、提高精子质量及科学指导"